Evaluation of several VLP „Plug & Display“constructs expressed in Pichia pastoris. Which will continue as the core structurefor a future malaria vaccine?

Abstract

A purification protocol was developed with trial and error of an older virus-like particle-SpyCatcher with a specific loop insertion.Then, the virus-like particle core structure was genetically modified to contain “Plug & Display” peptide and proteins on its outside, as a potential core structure to display antigens. Three peptide sequences and three protein sequences were inserted into a different loop in the genome. These modified sequences were ordered, confirmed, and transformed into Pichia pastoris. These six constructs were labelled 1, 2, 3, 4, 5 and 6.After transformation, expression in the clones was tested and the best were selected to be cultured and purified. Each selected clone was cultured for a week and then purified through a standard procedure. This process includes resuspension, lysis, centrifugation, ÄKTA pure chromatography, and filtration. Several analytical methods such as SDS-Coomassie, western blot, silver staining, electron microscopy and dynamic light scattering were used during and after these procedures to confirm the presence of the desired virus-like construct. All results were evaluated to determine the best candidate to continue to animal trials. These constructs are just core structures to add antigens on with “Plug & Display” methods. The appropriate Catcher or Tag linked to an antigen must be added before any immunogenicity study can be made. In this case, the idea is to add known transmission-blocking malaria antigen to make an effective vaccine, but in theory, any other antigen can be used.

Hreinsunarferill var framkvæmdur og staðfestur með prófunum á eldri vírus-líkri SpyCatcher byggingu með ákveðnu lykkju innskoti.Vírus-lík grunnbygging var erfðabreytt þannig að hún innihélt „Plug & Display“ peptíð og prótein í byggingu sinni. Þessi bygging er gerð til að sýna mótefnavaka á yfirborði sínu. Þrjár peptíðraðir og þrjár próteinraðir voru komnar fyrir í nýrri lykkju í erfðaefni vírus-líku sameindarinnar. Þessar erfðaefnisraðir voru pantaðar, staðfestar og umbreyttar í tjáningarkerfi Pichia pastoris. Byggingarnar sex fengu númerun frá 1-6.Eftir umbreytingu voru klónarnir prófaðir og þeir bestu voru valdir til áframhaldandi ræktunar og hreinsunar. Hver próteinbygging var ræktuð í eina viku og hreinsuð í kjölfarið samkvæmt stöðluðum aðferðum. Þær fólu í sér endur upplausn, frumurof, notkun skilvindu, notkun ÄKTA pure súluskiljunaraðferðum og síun. Nokkrar greiningaraðferðir voru notaðar í þessu ferli til að staðfesta að vírus-lík sameind sé til staðar, s.s. SDS-Coomassie, prótínþrykk, silfur litun, rafeindasmásjá og ljósbrotsmælingar. Allar niðurstöður voru metnar til að ákveða hvaða efni ætti að halda áfram í dýratilraunir.Þessar vírus-líku sameindir eru aðeins kjarni, síðan þarf að bæta við mótefnavökum utan á með „Plug & Display“ aðferðum. Viðeigandi „Catcher“ eða „Tag“ tengt við mótefnavaka þarf að bæta við í lausnina áður en ónæmissvörun er skoðuð. Í þessu tilfelli er stefnan að bæta við smit-stoppandi malaríu mótefnavaka svo hægt sé að búa til virkt bóluefni, en samkvæmt fræðunum þá er hægt að bæta við hvaða mótefnavaka sem er við þetta kerfi.