Biomarker analysis for APRT deficiency diagnosis using UPLC-MS/MS

Abstract

Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) deficiency is a rare genetic disorder.Since activity of the APRT enzyme is absent, adenine is oxidized and forms2,8-dihydroxyadenine (DHA). DHA is insoluble in urine and can precipitate and formkidney stones, which can cause acute and chronic kidney failure. The disease can betreated with the drugs allopurinol and febuxostat, which prevent the conversion ofadenine to DHA and thus reduce formation of kidney stones in APRT deficiencypatients.UPLC-MS/MS method for simultaneous quantification of DHA, adenine and thedrugs, allopurinol, oxypurinol and febuxostat in human plasma had been developed.The objective of this study was to perform full validation of the UPLC-MS/MSquantification method according to method validation guideline from Food and DrugAdministration (FDA Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry, 2018).Following full validation of the UPLC-MS/MS method, plasma samples from patientswith APRT deficiency will be studied.The sample preparation procedure was optimized prior to conductance of fullvalidation of the UPLC-MS/MS quantification method. During the validation process,the performance of the analytical column changed, shown by a deterioration ofchromatographic peak shape of the analytes and increased column pressure.Therefore, investigation of different batches of analytical columns was conducted andthe results indicated that column properties changed following analysis of humanplasma extracts. It was concluded that further investigation of this phenomena isneeded before conducting the full validation procedure. However, due to COVID-19epidemic the laboratory was temporarily closed before the issue could be resolvedand no further work could be conducted.

Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) skortur er sjaldgæfur erfðasjúkdómur.Þar sem virkni APRT ensímsins er ekki til staðar er adenine umbreytt í2,8-dihydroxyadenine (DHA). DHA er torrleyst við sýrustig þvags og getur fallið út ogmyndað nýrnasteina, þetta getur leitt til bráðrar og krónískrar nýrnabilunar. Hægt erað meðhöndla sjúkdóminn með lyfjunum allopurinol og febuxostat, sem koma í vegfyrir myndun á DHA og draga þannig úr nýmyndun á nýrnasteinum.UPLC-MS/MS mæliaðferð fyrir samtímis magngreiningu á DHA, adenine og lyfjunumallopurinol, oxypurinol og febuxostat í blóðvökva hefur verið þróuð. Markmiðverkefnisins var að framkvæma fulla gildingu á þessari mæliaðferð, þar sem stuðstverður við verklýsingar um gildingu frá Food and Drug Administration íBandaríkjunum (FDA Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry, 2018).Þegar að mæliaðferðin hefur verið fullgilduð þá verða blóðvökvasýni frá sjúklingummeð APRT skort rannsökuð.Sýnameðhöndlunin fyrir mæliaðferðina var betrumbætt áður en hefja átti gildinguna.Tæknilegir erfileikar varðandi súluna í UPLC-MS/MS tækjabúnaðnum semeinkenndust af hækkuðum þrýstingi og minni greiningarsvörun komu upp þegartilraunir fyrir gildingu hófust. Rannsókn á mismunandi súlum var gerð, niðurstöðurnarbentu til þess að eiginleikar súlunnar breyttust í kjölfar greiningar á blóðvökvasýnum.Það var komist að þeirri niðurstöðu að frekari rannsókn á þessu vandamáli þyrfti aðframkvæma áður en full gilding á mæliaðferðinni væri framkvæmd. Vegna COVID-19faraldursins var rannsóknarstofunni tímabundið lokað áður en hægt var að leysavandamálið.