is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/35764

Titill: 
  • MITF í sortuæxlisfrumum stökkbreytt með prime editing aðferðinni
  • Titill er á ensku MITF in melanona cells mutated using prime editing
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Við leit að stökkbreytingum sem gætu bælt svipgerðir Mitf stökkbreytinga í mús fannst bælibreytingin MitfMi-sl en hún bætir upp svipgerðir stökkbreytinga í Mitf. Í arfhreinu ástandi veldur þessi breyting brúnum feldi en það þykir benda til nývirkni. Stökkbreytingin K316X veldur ótímabærum stopptákna þannig að 104 amínósýrur vantar aftast í prótínafurðina en þar er að finna svæði sem hafa áhrif á virkni Mitf, m.a. súmóýleringarset en vanvirkni þessa sets hefur verið tengt við aukna áhættu á húð- og nýrnafrumukrabbameini. Til þess að skoða áhrif stökkbreytingarinnar var notast við prime editing erfðabreytingaraðferðina til þess að útbúa þessa stökkbreytingu í A375P sortuæxlisfrumulínunni. Auk þess voru MitfMi-sl, MitfMi-sp, MITFE318K og MitfMi-white stökkbreytingarnar yfirtjáðar á plasmíðum í A375P og áhrif yfirtjáningar þeirra greind með Western þrykki og RT-qPCR greiningu. Plasmíð fyrir prime editing voru búin til og frumur genaleiddar með þeim en ekki er búið að raðgreina frumurnar til að staðfesta að erfðabreytingin hafi gengið. Western þrykkin virkuðu ekki. RT-qPCR greiningin sýndi að yfirtjáning plasmíðanna virkaði og leiddi í ljós að mínusform MITF olli bæði aukinni eða minnkaðri tjáningu markgena en áhrifin eru mismunandi milli stökkbrigða MITF. Yfirtjáning villigerðar MITF eða MitfMi-sp plasmíðanna leiddi til minni tjáningar á innlægu MITF en MITFE318K og MitfMi-white yfirtjáning leiddi til aukinnar tjáningar innlægs MITF. Frekari rannsókna er þörf til að staðfesta þessar niðurstöður.

  • Útdráttur er á ensku

    A screen for mutations that suppress the phenotype of Mitf mutations in mice uncovered a mutation termed MitfMi-sl which supresses the phenotypes of other mutations in the gene. In homozygous condition, the mutation leads to a brown coat, possibly indicating a neomorphic function of the mutation. MitfMi-sl is a mutation which causes a premature stop codon, K316X, resulting in a truncated protein and loss of several functional sites, including a sumoylation site. The sumoylation site has been linked to increased risk of melanoma and renal carcinoma. The properties and neomorphic function of MitfMi-sl might reveal new information regarding the function and regulation of MITF. To examine this mutation, prime editing was used to introduce this mutation in the MITF gene in A375P melanoma cells. In addition, the MitfMi-sl, MitfMi-sp, MITFE318K and MitfMi-white mutations were overexpressed from plasmids and the effects of their overexpression determined using Western blotting and RT-qPCR. Prime editing plasmids were designed and transfected into cells and colonies cultivated and picked. We are now awaiting genome sequencing to determine whether the editing worked. The western blots did not work. RT-qPCR revealed that the effects of overexpressing wildtype MITF and MitfMi-sp resulted in reduced expression of endogenous MITF whereas overexpression of MITFE318K and MitfMi-white resulted in increased expression. Further research is needed to confirm these results.

Samþykkt: 
  • 2.6.2020
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/35764


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
Eyvindur_BS_Final.pdf1.94 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
Skemman_yfirlysing_EAS.pdf202.98 kBLokaðurYfirlýsingPDF