Affecting binding of chloride ions to Vibrio alkaline phosphatase with site-directed mutagenesis

Abstract

Í þessari rannsókn var alkalískur fosfatasi úr kuldakæru sjávarörverunni Vibrio splendidus (VAP) skoðaður en síðastliðin ár hafa rannsóknir á alkalískum fosfatasa upplýst margt um virkni þess og byggingu. Áhersla hefur verið lögð á að rannska víxlverkanir við NaCl, en nýlega tókst að greina kristalsbyggingu ensímsins við kristalaðstæður með líffræðilegum styrk NaCl í sjó, og þar með gera grein fyrir bindingu klórjóna í tvö bindiset. Í þessu verkefni var fengist við að koma fyrir þremur einstökum stökkbreytingum í ensíminu til að riðla bindingu klórs og kanna áhrif áhrif þessara stökkbreyttu afbrigða með tilliti til virkni og stöðugleika í mismunandi styrk af salti. Afbrigðin þrjú: K422L, Y423F og A221D voru rannsökuð og áhrif NaCl á virkni og stöðugleika. Öll afbrigði sýndu háa virkni með auknu magni af salti en Y423F reyndist vera óstöðugastur meðal afbrigðanna þegar borin voru saman T50% gildi þess við villigerð, á meðan áhrif á K422L voru vægari m.t.t. stöðugleika. Á hinn bóginn reyndist A221 hafa lítil áhrif á stöðugleika, með svipuð T50% gildi og villigerð.

In this study, alkaline phosphatase from the cold adapted marine bacterium Vibrio splendidus (VAP), was examined. Research on VAP over the past few years, has indicated a complex relationship with NaCl on activity, structure and stability of the enzyme. The focus has been on the interactions between NaCl and the enzyme. Recently its crystal structure was solved in the presence of NaCl, where two novel binding sites of chloride were discovered. In this project site-directed mutagenesis was performed with the intention of disrupting chloride ion binding. The three variants: K422L, Y423F and A221D were analysed and the effect of NaCl on activity and stability was examined. All variants showed high activity under increasing salt concentration, but among the variants, Y423F was the most unstable when comparing its T50% values to the wild-type, while the destabilizing effect on K422L was smaller. On the other hand, there was very little effect on the thermal stability of A221D, with similar T50% values as the wild-type.