Detection of the Archaeome in the Human Gastrointestinal Tract

Abstract

The human body carries trillions of microbial cells, even outnumbering human cells, and houses about hundred times more bacterial genes then human genes. Research on the human microbiome has focused on the bacterial domain and because of methodological problems, the presence and abundance of archaea has been consistently overlooked in conventional 16S rRNA gene amplicon surveys. In this project several of the known methodological problems to detect archaea in gastrointestinal tract are addressed in order to improve detection methods and quantify archaeal signatures.Sampling methods and specialized fecal sampling kits were compared. Also,different methodological set-ups using different primer conditions and previously established PCR procedures were tested. Amplification of the 16S rRNA gene was successful and enabled amplicon analysis with the Illumina Miseq next generation sequencing. Little difference in microbial communities was detected between samples acquired with different sampling kits. Data analysis revealed about 0.4% archaeal signatures of Methanobrevibacter in two of the stool test samples when using universal primers.With a nested methodological PCR setup, one additional archaeal sequence variant was detected despite originating from the same archaeal species.Lastly, the archaeal and bacterial signatures were quantified using a qPCR SYBR approach, revealing a bacterial load of 107 copies of 16S rRNA gene per total DNA in the stool samples. Of the total stool DNA between 0.5% and 1% were attributed to archaeal signatures. The main issue of the project was in accurately measuring the DNA concentration of standard samples and optimisation of the standard. This could easily be resolved in future studies with more precise quantification allowing for more accurate results.

Mannslíkaminn hefur að geyma billjónir örvera sem eru jafnvel fleiri en líkamsfrumurnar. Einnig býr hann yfir hundrað sinnum stærra bakteríuerfðamengi en erfðamengi manns-frumnanna sjálfra. Rannsóknir á örveruflóru mannsins, svo sem hefðbundnar greiningar á 16S rRNA genum, hafa einblínt á bakteríuhluta hennar vegna þess að skort hefur aðferðir til þess að greina og meta aðra þætti, eins og arkeuflóruna. Í þessu verkefni verður leitast eftir að bæta þekkt vandamál við greiningu arkea í meltingarfærum.Í verkefninu voru bornar saman sýnatökuaðferðir og aðferðasett. Með þekktum aðferðum við PCR mögnun tókst að magna hluta 16S rRNA gensins og raðgreining genabútanna gat farið fram með Illumina Miseq raðgreiningartækni. Niðurstöðurnar sýndu lítinn mun á örveruflóru milli sýnanna, sem fengust með ólíkum sýnatökuaðferðum. Niðurstöður tveggja sýna bentu til þess að 0,4% örveruflórunnar tilheyrðu arkeum, nánar tiltekið tegundinni Methanobrevibacter smithii, þegar notaður voru almennir vísar. Með stigskiptri PCR upp- setningu greindist einu raðbrigði meira (samtals tvö) en bæði komu þó frá M. smithii.Að lokum var gerð magngreining á dreifkjörnungum í saursýnum með qPCR og SYBR aðferð. Niðurstöður bentu til þess að u.þ.b. 107 eintök 16S rRNA bakteríugena væru til staðar í hverju sýni. Einnig að hlutfall arkea af dreifkjörnungum væri 0,5% til 1% í sýnum þar sem arkeur greindust. Ekki greindust arkeur í öllum sýnum sem til skoðunar voru. Helsta vandamálið sem upp kom við verkefnið var að mæla DNA styrk staðla af nægilegri nákvæmni til að gera staðalkúrfur sambærilegar milli mælinga. Auðveldlega má bæta úr því við frekar rannsóknir með ítarlegri mælingum á styrk staðla fyrir qPCR.