Characterization of critical glycolytic enzyme paralogs in the symbiotic cyanobacterium Nostoc sp. N6

Abstract

During characterization of its genome, Nostoc sp. N6, a cyanosymbiote, was found to carry a paralog of two initial enzymes from the glycolytic oxidative pentose phosphate pathway (OPP). This warranted additional investigation as the OPP is the primary pathway of glycolysis in Nostoc, and is critical in maintaining the reducing potential provided by NADPH for both biosynthesis and nitrogenase activity. Redundant paralogs are quickly silenced if they are not under constant positive selection, so this study sought to characterize these enzymes and establish what novel functionalities sustain their continued survival. Genes encoding Zwf and Gnd paralogs were isolated from Nostoc sp. N6 via PCR, Gibson assembled onto a C-terminal His-tagging vector and expressed within a suitable host for Ni-NTA column purification. The primary characteristics investigated were optimal pH and kinetic constants, which was followed up with multisubstrate assays, homology modeling and a phylogenetic study. The Zwf paralogs displayed characteristics indicating activation by OpcA, a cofactor for Zwf found mostly in cyanobacteria. Surprisingly, to activate Zwf2, OpcA must primarily affect affinity for NADP+ rather than G6P, and the phylogenetic study indicated a point of origin earlier than the development of cyanobacteria. For the Gnd paralogs the common enzyme displayed typical features, although its pH optimum was unusually distant from Zwf. The shorter paralog possessed no significant phylogeny outside of Nostoc and displayed minimal activity and structural features. This Gnd paralog might be a case study on the fate of a duplication failing to develop a novel function.

Við greiningu á erfðamengi Nostoc sp. N6, blágrænni sambýlisbakteríu, var uppgötvað að tegundin bar í sér tvöföldun af tveim fyrstu ensímum frá glýkólýtíska oxandi pentósa fosfat ferlinu (OPF). Þetta kallaði á frekari rannsóknir þar sem OPF ferlið er meginferli glýkólýsu í Nostoc, og er nauðsynlegt til að viðhalda andoxunargetu í gegnum NADPH bæði fyrir nýmyndun og niturnám nítrógenasa. Tvöfaldanir eru fljótlega þaggaðar ef þær eru ekki undir sífelldu jákvæðu vali, svo þessi rannsókn leitaðist eftir því að einkenna þessi ensím og gera grein fyrir þeirri nývirkni sem viðheldur tilvist þeirra. Erfðaefni Zwf og Gnd tvöfaldana var einangrað úr Nostoc sp. N6 með PCR, Gibson samsett í C-enda His-merkjandi genaferju, tjáð í viðeigandi tjáningarhýsl og próteinin svo Ni-NTA súluhreinsuð. Helstu einkenni sem voru athuguð var æskilegt pH og hraðafræðistuðlar. Þessu var svo fylgt eftir með fjölhvarfefna virknigreiningu, byggingu jafngildislíkans og greiningu á þróunarsögu.Zwf tvöföldunin sýndi einkenni sem kölluðu á virkjun með OpcA, hjálparprótein fyrir Zwf sem finnst helst í blágrænbakteríum. Óvenjulega, til að virkja Zwf2 þarf OpcA helst að hafa áhrif á sækni í NADP+ frekar en G6P. Greining á þróunarsögu Zwf tvöföldunarinnar sýndi svo fram á að hún hefur líklega orðið áður en blágrænbakteríur greindust frá öðrum bakteríum. Í Gnd tvöfölduninni virtust eiginleikar algengara ensímsins dæmigerð, en æskilegt pH var óvenjulega langt frá Zwf. Styttri tvöföldunin á litla þróunarsögu fyrir utan Nostoc ættkvíslina og sýndi takmarkaða virkni og byggingu. Gnd tvöföldunin gæti því verið dæmisaga um örlög tvöföldunar sem nær ekki að þróa með sér nýja virkni.