is Íslenska en English

Lokaverkefni (Meistara)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > Meistaraprófsritgerðir - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: http://hdl.handle.net/1946/37130

Titill: 
  • Titill er á ensku Effect of the CAAD domain on nitrogenase localization within cyanobacterial heterocysts
Námsstig: 
  • Meistara
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    Nitrogenases are environmentally important enzymes that fix inert dinitrogen into ammonia which can be utilized by organisms, being responsible for the majority of non-anthropogenic inputs of accessible nitrogen in nature. Recently, a membrane protein anchor known as the CAAD domain was discovered to be appended to vanadium nitrogenase in certain cyanobacterial strains. The CAAD domain is known to localize to thylakoid membranes and in cyanonbacterial heterocysts (terminally differentiated cells specialized for nitrogen fixation) they have been shown to localize specifically to so-called honeycomb membranes located at the heterocyst poles. Localization of vanadium nitrogenase to honeycomb membranes may increase the rate of nitrogenase activity due to the high metabolic activity of the honeycomb membranes, and vanadium nitrogenase activity is known to be energetically costly. In this study, mutants containing CAAD-GFP (both with-and without vanadium nitrogenase attached) fusion proteins were generated and observed using confocal microscopy to investigate the localization of CAAD-appended nitrogenase within heterocysts. During the process of mutant selection some surprising morphological features were observed, where cultures grown in spectinomycin medium (for selection) assumed an aggregated, non-filamentous morphology resembling the aseriate stage of cyanobacteria which is associated with symbiosis. Another abnormal feature was observed during fluorescence microscopy, where heterocysts emitted relatively strong fluorescence in the green range, which has not been documented in the literature previously. This feature obfuscated GFP localization somewhat, which was partially amended by dark adaptation of cells and immersion in potassium-phosphate buffer which prevented light adaptation during fluorescence microscopy. However, some background fluorescence remained in heterocysts of dark adapted cultures, requiring the use of statistical methods (t tests) to establish whether GFP was actually being expressed. This showed that some of the mutant strains were most probably expressing GFP, yet no meaningful localization at the heterocyst poles was observed. However, some other curious features were observed in mutant strains, such as sporadic localization of GFP fluorescence within heterocysts, and complete absence of fluorescence at the poles of some mutant heterocysts, contrary to the prediction that the CAAD domain localizes to the polar honeycomb membranes.

  • Nítrógenasar eru mikilvæg ensím í náttúrunni þar sem þeir gera frumum kleift að binda óaðgengilegt nitur úr andrúmsloftinu í ammóníak sem lífverur geta nýtt sér, en nítrógenasar eru í raun uppspretta meginhluta aðgengilegs niturs í náttúrunni sem ekki er bundið af mönnum (Haber-Bosch ferlið). Nýlega fannst prótein-akkeri sem nefnist CAAD hneppi tengt við vanadíum nítrógenasa í ákveðnum tegundum blágrænubaktería. Vitað er að CAAD hneppið binst á ljóstillífunarhimnum bæði í vaxtarfrumum og ‘heterocyst’ frumum (sérhæfðar niturnámsfrumur). Innan heterocyst frumna virðist CAAD hneppið bindast á sérstökum býkúpuhimnum heterocyst frumna, sem eru staðsettar á endum frumunnar næst aðlægum vaxtarfrumum. Það gæti verið að þessi staðsetning geti aukið virkni nítrógenasa þar sem vitað er að í og við býkúpuhimnur er mikil metabólísk virkni og virkni vanadíum nítrógenasa er mjög orkufrek. Í þessari rannsókn voru erfðabreyttar blágrænubakteríur með CAAD-tengt GFP (bæði með-og án vanadíum nítrógenasa) útbúnar og skoðaðar með flúrljómunarlagsjá svo að hægt væri að skoða staðsetningu CAAD hneppisins innan heterocyst frumna. Þegar valið var fyrir erfðabreyttum stofnum með spektínómýsín valæti sáust sérstakar breytingar í vaxtarlagi kólónía, en þær mynduðu óvenjulegar þyrpingar sem helst svipa til ‘aseriate’ vaxtarlags sem tengist samlífi, en það sama gerðist þegar óerfðabreyttar frumur voru settar í þetta valæti. Annar sérstakur eiginleiki bakteríanna sem var óvenju mikil bakgrunnsflúrljómun grænna bylgjulengda, sem virðist ekki hafa verið lýst áður. Þessi eiginleiki gerði það að verkum að erfitt var að greina GFP, sem einnig flúrljómar grænu ljósi. Þó var hægt að minnka bakgrunnsflúrljómun talsvert með því að aðlaga ræktirnar að myrkri og setja þær síðan í fosfór-kalíum dúa, sem kom í veg fyrir að þær aðlöguðust að ljósi meðan þær voru skoðaðar með lagsjá. Þrátt fyrir þetta tókst ekki að losna við alla bakgrunnsflúrljómun og því var tölfræðilegum aðferðum (t prófum) beitt til að sjá hvort þær tjáðu í raun GFP. Þetta sýndi að sumar erfðabreyttar heterocyst frumur tjáðu greinilega GFP, en ekki sást nein markverð staðsetning GFP í endum heterocyst frumna. Hins vegar virtist dreifing innan heterocyst frumna ekki vera jöfn heldur sýndi eins konar punktdreifingu, en einnig voru ákveðin svæði innan þessara frumna alveg laus við flúrljómun, einkum í frumuendunum, öfugt við spána að CAAD hneppið bindist sérstaklega við býkúpuhimnur í frumuendum.

Samþykkt: 
  • 2.10.2020
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/37130


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
MS-thesis-KalmanChrister.pdf3.06 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
Yfirlýsing.pdf46.52 kBLokaðurYfirlýsingPDF