Conformational dynamics of NCS-1 observed with single molecule spectroscopy

Abstract

Neuronal calcium sensor 1 (NCS-1) is a protein expressed in all living organisms and mostly in neurons. In humans, it has an important role in synaptic plasticity, learning and memory, and neurodegeneration. NCS-1 senses changes in calcium concentration with conformational changes which render it active to interact with many binding partners. NCS-1 has four calcium-binding EF-hands organized in two domains and has an intrinsically disordered C-terminal tail that lacks a defined conformation. It is known that the tail occupies a hydrophobic crevice on NCS-1 when bound to calcium, stabilizing the native structure, but little information is available on the magnesium-bound and the apo states. Studying disordered regions can be challenging due to their heterogeneous conformational ensembles and dynamic nature. Many ensemble structural biology methods are insensitive to changes in protein conformation because they result in averages of molecular events that occur during the experiment. Single-molecule FRET (smFRET) measurements are, on the other hand, a collection of independent events from individual molecules and can therefore detect transient and rare molecular processes. In this project the aim was to study the conformational dynamics of NCS-1, including its disordered C-terminal tail, using smFRET. Cysteine variants were successfully produced and labeled with two distinct fluorophores in positions 4 and 188, effectively probing the end-to-end distance of the entire protein, including the C-terminal tail. Equilibrium unfolding experiments in the absence or presence of divalent ions revealed a rich unfolding mechanism with many intermediate states, in agreement with previous results. Surprisingly, the native conformation of the apo-state, magnesium-bound state, and calcium-bound state all had essentially identical end-to-end distances between the fluorophores whereas the stability of these states was drastically different. Furthermore, the apo-state, which has classically been considered a molten-globule, unfolded through multiple intermediate states, implying a well-folded structure. Overall, the results suggest that the intrinsically disordered C-terminal tail may play a role in stabilizing the native conformation independently of ion binding and that the apo-state properties may be more complex than previously thought.

Neuronal calcium sensor 1 (NCS-1) er prótein sem er tjáð í öllum lífverum og að mestu leyti í taugafrumum. Próteinið gegnir mikilvægu hlutverki í eiginleikum taugamóta í mönnum, við getuna að muna og læra, og í taugahrörnum. NCS-1 skynjar breytingar í kalsíum styrk innan frumu með breytingum á myndbyggingu sinni sem leiðir til þess að próteinið getur bundist mismunandi marksameindum, NCS-1 hefur fjórar EF-hendur sem raðað er í tvö hneppi og það hefur óreiðukenndan C-enda hala sem skortir stöðuga byggingu. Það er þekkt að þessi C-enda hali fyllir upp í vatnsfælinn vasa á NCS-1 í fjarveru bindils þegar það er bundið kalsíum jónum en lítið er vitað um eiginleika próteinsins þegar það er bundið magnesíum eða þegar það er ekki bundið neinum jónum. Það getur reynst erfitt að rannsaka óreiðuprótein þar sem hreyfanleiki próteinanna er mikill. Flestar hefðbundnar aðferðir eru ónæmar fyrir skyndilegum breytingum á byggingu próteinanna vegna þess að þær greina meðaltal margra atburða sem gerast á meðan tilrauninni stendur. Einsameinda FRET mælingar gefa hins vegar upplýsingar um sjálfstæða atburði og geta því numið skammlíf og sjaldgæf ferli innan sameinda. Í þessu verkefni var markmiðið að skoða NCS-1, þar á meðal óreiðu C-enda halann með einsameinda FRET. Cystein afbrigði af NCS-1 voru útbúin og merkt með tveimur mismunandi flúrljómandi hópum í stöðum 4 og 188 þannig að hægt var að rannsaka próteinið frá enda til enda. Jafnvægis afmyndunar tilraunir í fjarvist og viðurvist tvígildra jóna sýndu afmyndunarferla með mörgum milliástöndum sem var í samræmi við fyrri rannsóknir. Það kom á óvart að svipmótuð bygging próteinsins í fjarvist og viðurvist tvígildra jóna hafði nokkurn vegin sömu fjarlægðina á milli flúrljómandi hópanna en stöðugleiki þessara ástanda var gjörólíkur. Niðurstöðurnar gefa til kynna að óreiðukenndi C-halinn gæti spilað mikilvægt hlutverk í stöðgun á svipmótaðri byggingu próteinsins, óháð bindingu jóna auk þess sem að eiginleikar apo-stigsins gætu verið margbrotnari en áður var talið.