Development of ELISA method to evaluate the effect of N-acetylcysteine intake on cystatin C in patients with Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopathy

Abstract

Hereditary cystatin C amyloid angiopathy (HCCAA) is an autosomal dominant type of cerebral amyloid angiopathy caused by an SNP (Single Nucleotide Polymorphism) called L68Q in the cystatin C gene, CST3. It leads to production of an unstable variant of human cystatin C (hCC) that has an increased tendency to aggregate and form amyloid deposits, predominantly in the cerebral arteries. The mutant cystatin C amyloid deposits damage the smooth muscle cells in the arterial walls making them prone to breakage and causing hemorrhagic stroke leading to brain damage, dementia and ultimately death. Antioxidants, like N-acetyl cysteine (NAC), have been shown to disrupt amyloid precipitation. Arctic Therapeutics ehf. has been conducting a clinical study (AT1-HCCAA) involving individuals, confirmed to carry the L68Q mutation, to test these properties of NAC. The aim of this project was to develop a method that could quantify human cystatin C levels in plasma and urine and measure analytes in samples from participants in the aforementioned AT1-HCCAA study. Although commercial ELISA assays are available, they have, notwithstanding their high cost, several limitations. Developing such a method, tailored to the specific needs of a project, is a great benefit for monitoring disease progression and evaluate potential medical treatment options. A direct sandwich ELISA for the detection of human cystatin C using monoclonal capture and detection antibody has been developed. Preliminary data indicate that the assay is suitable for detection of human cystatin C in biological samples. However, due to uncontrollable events during the course of this project, it was not possible to measure participants samples at this point. The ELISA assay developed in this project shows great potential but needs some further experiments and refinement.

Arfgeng heilablæðing (Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopathy (HCCAA)) er tegund af heilamýlildissjúkdómi sem erfist ókynbundið ríkjandi og stafar af einkirnabreytingu (L68Q) í cystatin C geninu, CST3. Stökkbreytingin leiðir til myndunar á óstöðugum afbrigðum af cystatin C próteini sem hafa tilhneigingu til að mynda mýlildi, þá helst í æðaveggjum heilaslagæða, og valda útfellingum sem leiða til heilablæðinga, heilabilunar og dauða hjá ungum arfberum. Sýnt hefur verið fram á að andoxunarefni eins og N-acetyl cysteine (NAC), geti dregið úr myndun útfellinga. Arctic Therapeutics ehf. hefur undanfarið leitt klíníska lyfjarannsókn (AT1-HCCAA), þar sem virkni lyfsins NAC er rannsökuð hjá einstaklingum með staðfesta stökkbreytingu á CST3 geni.Markmið verkefnisins var að þróa næmt og áreiðanlegt ELISA próf sem aðferð til að mæla magn cystatin C í lífsýnum, m.a. blóðvökva og þvagi, einstaklinga í fyrrnefndri AT1-HCCAA rannsókn. Þó að það sé vissulega mögulegt að kaupa tilbúin ELISA próf fyrir flest prótein í dag þá hafa þau, að frátöldum háum kostnaði, sínar takmarkanir. Þróun slíkrar aðferðar, sem er sniðin að þörfum ákveðins verkefnis, koma að miklu gagni í tengslum við eftirfylgni og framvindu sjúkdóms sem og til að meta mögulega meðferðarúrræði. ELISA próf sem mælir cystatin C með tveimur einstofna mótefnum hefur verið þróuð. Fyrstu niðurstöður benda til þess að prófið henti til að mæla cystatin C í lífsýnum. Vegnaóviðráðanlegra aðstæðna sem komu upp meðan að á þessu verkefni stóð, gafst þó ekki rými til þess að mæla lífsýnin. Niðurstöður þróunarvinnu á ELISA prófi í þessu verkefni lofar þó góðu en nauðsynlegt væri að halda þeirri vinnu áfram fyrir áreiðanlegra próf.