Cyclic di-GMP in functional transition of Nostoc cyanobacteria

Abstract

Cyanobacteria are known to establish symbiosis (commensalism and mutualism) with a variety of other organisms, ranging from microorganisms to plants. When symbiosis between cyanobacteria and plants is established, cyanobacterial hormogo nia, motile filaments, are formed in the presence of external stimuli, for example sugars secreted by plants. Little is known about how the cellular mechanism worksduring this transition state, although differentially regulated gene loci have been observed during this transition. Previous studies have indicated increased expression of genes known to regulatelevels of cyclic di-GMP during the transition state. Cyclic di-GMP is a second mes senger used in signal transduction in many bacteria, including cyanobacteria. The planned approach to follow regulation of cyclic di-GMP in cyanobacterial cells with specially designed expression plasmids that were constructed using the Gibson assembly technique. These plasmids can indicate changes in levels of cyclic di-GMPwith ribosensors, and translation of genes of interest via a fluorescent protein re porter, with an added possibility of increasing expression of the gene of interest with a theophylline responsive riboswitch. These plasmids could then be integrated into the genome of the cyanobacterium Nostoc sp. Moss2 to observe signals from reporters that were integrated into the genome by homologous recombination with the chromosome.To confirm that the plasmids were correctly assembled, the inserts and seams were sequenced. Most of the plasmid constructs had errors so that they will have to be reassembled. The ones that had no errors supposedly integrated into the genome of Nostoc sp. Moss2 but did not reach enough mass in time to be confirmed and observed in the fluorescent microscope.However, this work generated the molecular tools with utility in investigating the role of cyclic di-GMP in Nostoc cyanobacteria, e.g. in the vegetative to motile cell transition.

Blábakteríur mynda sambýli (gistilífi og samhjálp) með ýmsum öðrum lífverum, allt frá örverum til plantna. Þegar sambýli milli blágrænnar bakteríu og plöntu er komið á, myndast hreyfanlegir þræðir, hormogonia, í viðurvist utanaðkomandi áreitis, til dæmis frá sykrum sem plöntur seyta. Lítið er vitað um gangvirkið í frumum á meðan þessu umbreytingarástandi stendur, þó hefur orðið vart við breytta tjáningu á ákveðnum genum við þessar umskipti. Fyrri rannsóknir hafa gefið til kynna aukna tjáningu gena, sem vitað er að stjórnastyrk hringtengds tví-GMP, meðan á þessari umbreytingu stendur. Hringtengds tví GMP er innboði sem notaður er í mörgum bakteríum, þar á meðal blábakteríum. Til þess að fylgjast með stýringu hringaðs tví-GMP í blábakteríum voru sérhön nuð tjáningarplasmíð smíðuð með Gibson samsetningaraðferðinni. Þessi plasmíð geta gefið til kynna breytingar á styrk hringaðs tví-GMP með ríbónemum og með tjáningu á markgenum, að viðbættum möguleika á að auka tjáningu á markgen inu með teófyllín stýrðum ríbórofa. Síðan voru þessi plasmíð samþætt erfðamengi blábakteríunnar Nostoc sp. Moss2 til þess að fylgjast með merkjum frá sýnigeni sem tengd voru markgeni með plasmíðinu. Til þess að staðfesta að plasmíðin hafi verið rétt sett saman voru innskotin ogsamskeytin raðgreind. Flest plasmíðin innihéldu villur þannig að þau þarf að setja saman aftur. Þau plasmíð sem inniheldu ekki villur, voru samþætt erfðamengi Nos toc sp. Moss2 en frumurnar náðu ekki nægum massa í tæka tíð til þess að hægt væri að staðfesta innlimun og fylgjast með þeim í flúrsmásjá. Hins vegar skapaði þessi vinna sameindaverkfæri sem nota má til að rannsaka hlutverk hringtengds tví-GMP í blágrænum bakteríum ásamt hlutverkum valinna markgena, t.d. í umbreytingunni frá vaxtarfrumum yfir í hreyfanlegar frumur.