Myndun stökkbreytingar í ATL2 geni með CRISPR/Cas12a í brjóstakrabbameinsfrumulínunni T47D

Abstract

Brjóstakrabbamein er algengasta krabbamein sem finnst í konum. Arfgengar stökkbreytingar eins og finnast í BRCA1/2 valda auknum líkum á myndun brjóstakrabbameina. Við leit að nýjum krabbameinsgenum fannst breyting í innröð í ATL2 geni sem eykur áhættu arfbera á að fá brjóstakrabbamein. Breytingin fannst ávallt arfblendin. Hún er staðsett í innröð 10 við splæsiset útraðar 11, þar sem 6T verða að 7T. Markmið verkefnisins var að mynda stökkbreytinguna ATL2 c.1129-3_1129-2insT með CRISPR/Cas12a tækni í brjóstakrabbameinsfrumulínunni T47D. Í verkefninu var notuð rafgötun til að innlima CRISPR flóka í frumur, síðan voru frumurnar klónaðar og svæðið í kringum breytinguna raðgreint með Sanger raðgreiningu til að meta breytingar í DNA af völdum CRISPR. Í verkefninu voru raðgreindir 162 klónar og af þeim voru fimm klónar jákvæðir fyrir ATL2 (c.1129-3_1129-2insT) stökkbreytingunni. Hins vegar voru allir klónar sem innihéldu breytinguna einnig með auka breytingar sem að öllum líkindum orsakast af endurklippingum frá Cas12a. Ekki er vitað hvort þessar umfram breytingar valda skertri tjáningu á ATL2 próteini, en í öllum tilfellum hafa þær einhver áhrif á basaröð gensins sem geta valdið lesrammabreytingum sem stöðva þýðingu próteinsins. Í verkefninu tókst að mynda ATL2 (c.1129-3_1129-2insT) stökkbreytinguna í T47D þó að henni hafi fylgt aðrar breytingar. Þrátt fyrir að ekki hafi tekist að mynda nothæfa frumulínu til frekari rannsókna þá er ljóst hvaða breytingar þarf að gera á aðferðum til að fá rétta breytingu í frekari tilraunum.

Breast cancer is the most common cancer found in women. Hereditary mutations such as in BRCA1/2 increase the risk of developing breast cancer. In search for new cancer genes, an internal mutation was found in the ATL2 gene, which increases breast cancer risk. The mutation is positioned in intron 10 near the splice site of exon 11 and forms an heterozygous insert, where 6T become 7T. The aim of this project was to generate the mutation ATL2 (c.1129-3_1129-2insT) in the ATL2 gene using CRISPR/Cas12a in the breast cancer cell line T47D. Electroporation was used to introduce the CRISPR complex into the cells, which were subsequently cloned and sequenced by Sanger sequencing to assess changes in DNA caused by CRISPR. 162 clones were sequenced, but only five clones included the ATL2 (c.1129-3_1129-2insT) mutation. However, all clones containing the mutation also had additional alterations which were probably caused by recutting from Cas12a. It is not known whether the additional mutations alter expression of ATL2 protein, but in all cases they have some effect on the base sequence of that gene, which can cause frame-shift that alters the protein translation. The results showed that the indel ATL2 (c.1129-3_1129-2insT) was introduced into breast cancer cell line but some unwanted mutations were seen as well. Even though cell line with the correct ATL2 mutation was not made, the project will serve as a basis for future work towards using CRISPR/Cas12a for insertional mutagenesis in breast cancer cell lines.