Design and development of a species-specific high-throughput molecular sexing assay for three bird species

Abstract

Í verkefninu voru hannaðar sameindalíffræðilegar kyngreiningaraðferðir, sem eru sértækar fyrir fuglategundirnar Podiceps auritus (flórgoði), Falco rusticolus (fálki) og Lagopus muta (rjúpa). Notast var við TaqMan qPCR aðferð en með henni er hægt að greina mörg sýni á fljótlegan og áreiðanlegan hátt. Bæði vísar og þreifarar voru hannaðir frá grunni í CLC Genomics Workbench, út frá erfðamengjum fuglana sem raðað var saman við Háskólann á Akureyri. Kyngreiningin byggir á að magna upp svæði af genunum CHD1-W og CHD1-Z sem eru á kynlitningum fuglanna, og nota flúrljómandi þreifara, sem eru sértækir fyrir hvorn litning, til magngreiningar. Þannig sýna karlfuglar með arfgerð ZZ aðeins eitt flúrljómandi merki en kvenfuglar með arfgerð WZ sýna tvö flúrljómandi merki. Tegundirnar þrjár eiga það sameiginlegt að vera vaktaðar með tilliti til stofnstærðabreytinga. Því getur það komið að miklu gagni að hafa til taks þessar nýju kyngreingaraðferðir sem leyfa kyngreiningar fyrir stór sýnasöfn. Fyrri tilraunir til að kyngreina flórgoðann með sameindafræðilegum aðferðum hafa ekki heppnast og þetta er því í fyrsta skipti sem tegundin hefur verið kyngreind á þennan máta. Hinar tvær tegundirnar er hægt að kyngreina með hefðbundinni PCR mögnun á CHD1 og rafdrætti á agargeli. Þessi aðferð er hins vegar bæði tímafrek og villugjörn og felst því mikil framför í því að geta kyngreint með TaqMan qPCR aðferð með þeim vísum og þreifurum sem voru hannaðir fyrir verkefnið.

New high-throughput species-specific molecular sexing assays were designed and developed in this study for each of the three bird species: Podiceps auritus (the horned grebe), Falco rusticolus (the gyrfalcon) and Lagopus muta (the rock ptarmigan). The assays are TaqMan qPCR assays based on the amplification of the CHD1 gameotologs. Fluorescent probes that anneal specifically to either the W or the Z gametolog are used for quantification. The samples from male birds (ZZ) give one fluorescence signal and the samples from female birds (WZ) give two fluorescence signals. Primers and probes were designed in CLC Genomics Workbench from draft genomes assembled at The University of Akureyri.All three of these species are closely monitored in Iceland due to changes in population sizes. Hence, these three high-throughput sexing assays could prove to be highly useful for ecological researchers that work with large sample numbers. The horned grebe has previously not been successfully sexed using molecular methods, so development of this molecular sexing assay is a significant progress. The other two species can be sexed with the conventional avian molecular sexing method of CHD1 PCR amplification and electrophoresis. That method is, however, both time consuming and error prone, so having the option of using TaqMan qPCR with the probes and primers designed in this study is an improvement.