Danio rerio for Studying the SmoR173C Variant in Hedgehog Signaling

Abstract

SMOR173C mislesturbreytingin er fyrsta stökkbreytingin sem fundist hefur í hedgehog boðleiðinni tengd aukinni hættu á slitgigt. Slitgigt er algengur hrörnunarsjúkdómur sem getur valdið afmyndun útlima og miklum sársauka. Meðferðarmöguleikar í boði eru takmarkaðir og engin lækning er til. SMO (Smoothened) próteinið er lykilhluti af hedgehog boðleiðinni og flytur hedgehog boð gegnum frumbifhár í hryggdýrum. Sú tilgáta hefur verið sett fram að áhrif SMOR173C séu vegna skertrar kólesterólbindingar og trufli þar með hedgehog boðferilinn. Í þessu verkefni voru áhrif SMOR173C stökkbrigðisins og SMO stökkbrigða sem valda skerti kólesteról bindingu á virkjun hedgehog boðferilsins könnuð in vivo í sebrafiskum. Þar sem sebrafiska Smo og manna SMO eru ekki alveg eins, var fyrsta viðfangsefnið að greina virkjunaráhrif hliðstæðu sebrafiska Smo stökkbrigðanna og bera þau saman við manna SMO. Í þeim tilgangi var sebrafiska Smo stökkbrigði yfirtjáð í MEF frumulínum án [músa]smo gens og virkjun þeirra í hedgehog boðferlinum athuguð. Næsta viðfangsefni var að kanna áhrif þess að bæla smo tjáningu í sebrafiskum með innsprautun morpholino í sebrafiska fóstur. Það var gert með því að meta hvort sebrafiskarnir sýndu svipgerð sem benti til glataðrar hedgehog boðferils virkni og með mælingu á Smo prótein gildum og virkjun hedgehog boðferilsins. Tilraunirnar gáfu engar afgerandi niðurstöður en veittu innsýn í notkun sebrafiska til rannsókna á SMOR173C stökkbrigðinu. Þessar tilraunir voru framkvæmdar til að öðlast betri skilning á áhrifum SMOR173C stökkbrigðisins á hedgehog boðferilinn og hlutverk hans í framvindu slitgigtar.

The SMOR173C missense variant is the first mutation found in the hedgehog pathway that is associated with increased risk of osteoarthritis. Osteoarthritis is a widespread degenerative joint disease that can cause deformity and pain in affected individuals. Effective therapeutic options are limited and there is no known cure. The SMO (Smoothened) protein is a vital part of the hedgehog pathway, transducing hedgehog signals via the primary cilium in vertebrates. It has been hypothesized that the SMOR173C alters cholesterol binding, causing dysregulated hedgehog signaling. This project studied the SMOR173C variant and SMO variants with defective cholesterol binding in hedgehog pathway activation in vivo using zebrafish. As zebrafish Smo is similar but not identical to human SMO, the first objective was to analyze the effect the analogous zebrafish Smo variants have on hedgehog signaling and compare the effects to their human SMO counterparts. For that purpose, MEF cell lines lacking the smo gene and overexpressing the zebrafish Smo variants were generated, and their effect on hedgehog signaling activation assessed. The second objective was to assess the effects of inhibiting smo expression in zebrafish by knocking down Smo by morpholino microinjection in zebrafish embryos. This was done by analyzing loss-of-function phenotypes, assessing Smo protein levels and hedgehog signaling activation. The results from these experiments were inconclusive but provided insight into the first steps of using zebrafish for studying SMOR173C. These studies were performed to better understand the effect of the SMOR173C on the hedgehog pathway and its role in the development of osteoarthritis.