Expression and purification of human histone proteins. Comparison of different methods for production of octamers

Abstract

Histone proteins are the fundamental units assembling an octamer which a DNA wraps around to form a nucleosome core particle. Nucleosomes have and continue to be extensively studied due to their important regulatory role of maintaining the genome. Among mechanisms that are involved is the accessibility of compacted DNA for transcription factors. The core histone proteins H1, H2A, H2B, H3 and H4 are needed to reconstitute nucleosomes in vitro. To allow research on the structure and dynamics of nucleosomes, technologies such as single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (sm-FRET) have spiked exceptional results of once far-reaching concepts. A good supply of histone proteins is important to have for research regarding dynamics of the DNA binding proteins to better the understanding of the immense regulation in cells. In this project, different methods were tested to produce human histone proteins H2A, H2B, H3 and H4. It was found that more conventional methods that have been improved throughout the years have established good protocols that work well but are time consuming. A rapid method skips steps in these well-established protocols and saves time. The rapid protocol seems to have promising results, however, it is a matter of whether the product has the same standard and quality as the conventional method.

Histónprótein eru grunneinignar áttliðuflóka sem DNA er vafið utan um og mynda þannig litnisagnir og þar með minnstu einingu þéttpakkaðs litnis. Histón próteinin eru H2A, H2B, H3, H4 og H1 og eiga stóran hlut í opnun og þöggun gena. Litnisagnir hafa verið skoðuð mikið í gegnum árin, meðal annars til að skilja byggingu og eiginleika þeirra ásamt víxlverkunum þeirra við umritunarþætti. Það er því er mikilvægt að taka tillit til þeirra þegar stjórnunarferli frumna eru skoðuð. Umritunarþættir sem geta bundið og lesið erfðaefni eru þekkt fyrir að vera mjög óreiðukennd og þarf því sérstaka tækni til að rannsaka þá. Sem dæmi má nefna ein-sameinda Förster ómorkuflutning (sm-FRET). Til þess að geta skoðað víxlverkanir litnisagna og umritnarþátta með þessari aðferð þarf að geta endursmíðað litnisagnir „in vitro“. Því er mikilvægt að hafa góðar birgðir af histónpróteinum til að geta dýpkað skilning okkar á þessum gríðarlega flóknu ferlum sem stjórna örlögum frumna. Í þessu verkefni, voru mismunandi aðferðir prófaðar til að framleiða histón próteinin H2A, H2B, H3 og H4. Hefðbundin aðferð sem hefur náð fótfestu virkar vel en er þó tímafrek. Fljótlegri leið hefur verið könnuð sem tekur styttri tíma og sleppir ákveðnum aðferðarskrefum. Komið hefur í ljós að fljótlega aðferðin virkar ágætlega en histón próteinin þurfa þó að vera með sama staðal og hreinleika í báðum aðferðunum til þess að fljótlegri aðferðin sé þess virði.