Tagging the CDH1 and CDH2 Genes in Melanoma Cells Using CRISPR Technology

Abstract

CDH1 og CDH2 eru type I cadherin sem taka þátt í bandvefsumbreytingu þekjuvefs (EMT). Þau eru sameindir á yfirborði frumna sem gegna hlutverki í frumu viðloðun. Margar rannsóknir hafa sýnt fram á að mismunandi tjáning CDH1 og CDH2 genanna breytir viðloðunareiginleikum og breyttri tengingu á milli frumna, sem leiðir til stjórnlausrar fjölgun, frumufari og innrásar frumna. Sortuæxli og aðrar tegundir krabbameinsfrumna sýna svipaða hegðun sem hefur leitt til mögulegra tenginga á milli tjáningar cadherins og krabbameinsmyndunar. Mismunandi virknistig MITF umritunarþáttarins hefur verið tengt við mismunandi tjáningu cadherins í sortuæxlisfrumum. Sortuæxli sem er lífshættulegt húðkrabbamein, hefur þá eiginleika að geta skipt um svipgerð í tengslum við mismunandi virknistigi MITF og CDH1 og CDH2 tjáningu. Til að skilja betur tjáningu CDH1 og CDH2 í tengslum við virknistig MITF, var ætlunin að þróa frumulínu sem tjáir CDH1 og CDH2 með flúrljómandi próteinum með því að nota CRISPR knock-in tækni. Slík nálgun getur virkað sem ‚ljósrofi‘ fyrir tjáningu CDH1 og CDH2. Til að undirbúninga innleiðingu flúrljómandi próteinanna voru gRNA og DNA raðir hannaðar. DNA raðirnar, ásamt völdum plasmíðum voru magnaðar upp og settar í E. coli bakteríur til klónunar. Síðan var DNA þeirra einangrað og staðfest með raðgreiningu til að sjá hvort tekist hefði að útbúa genaferjurnar. DNA raðgreiningin sýndi ófullnægjandi niðurstöður sem geta stafað af mörgum þáttum úr undirbúningsferlinu, sem væri vert á að skoða nánar í framtíðinni.

CDH1 and CDH2 are type-I cadherins involved in epithelial-to-mesenchyme transition (EMT), they are cell surface molecules that play a role in cell-to-cell adhesion. Many studies have shown that different expressions of CDH1 and CDH2 form different adhesive properties and altered spatial relations of cell-to-cell adhesion, which leads to uncontrolled proliferation, migration and invasion. Melanoma and other types of cancer cells show similar behaviors that have led to possible correlations between cadherin expressions and cancer formation. Different activity levels of the transcription factor MITF are linked to different expressions of these cadherins in melanoma cells. Melanoma, a life-threatening skin cancer, has been shown to have phenotype switching abilities in relation to different activity levels of MITF in regulation to CDH1 and CDH2 expression. To better understand the expression of CDH1 and CDH2 in correlation with activity levels of MITF, the goal was to generate a cell line with these genes tagged with fluorescent markers using CRISPR knock-in technology. This approach can work as a ‘light switch’ for the expression of CDH1 and CDH2. In preparation for the knock-in of fluorescent markers, gRNA and replacement vectors were designed. Replacement vectors and selected plasmids were amplified and put into E. coli cells for cloning, followed by isolation of the DNA and verification by sequencing. DNA sequencing of the replacement vectors showed inaccurate sequence results which can be caused by many factors from the preparation processes that need to be further analyzed in the future.