The expression, purification and labelling of HMGA1a

Abstract

The fundamental process of converting our DNA to mRNA, which can then be translated into a protein, is carried out by a special set of proteins called transcription factors. They govern the process of gene transcription by recognizing a particular DNA sequence, which then enables them to recruit cofactors that can either activate or repress transcription. The Eukaryotic transcription factors all have a global architecture that makes them able to carry out their important roles in gene expression. All transcription factors possess some regions that have no well-defined three-dimensional structure, and some are even completely disordered. These proteins are called intrinsically disordered proteins, but it is estimated that they constitute to at least a third of the human proteome. High-Mobility group (HMG) is a group of proteins that belong to a family of disordered architectural transcription factors. They are involved in many different nuclear processes and are known to interact with nucleosomes. Together with linker histone H1, they were the first nuclear proteins known to affect the structure of chromatin. The compaction of chromatin is closely linked to the presence of H1, and as a result, the cell has developed regulatory mechanisms to actively remove H1 from nucleosomes. HMGA1a is one of those, but it’s an intrinsically disordered protein known to be able to compete with linker histone H1 on binding the nucleosome. During the time course of this project, we were able to successfully express and purify the HMGA1a transcription factor. In addition, we attempted to label the protein with both donor and acceptor fluorescent dyes, by attaching them at two cysteine residues. Since the native protein contains no such residues in its sequence, we had to use a double-cysteine mutant version of the protein. The goal was to get a double-labelled protein so it could be used for smFRET measurements, ideally in complexes with reconstituted nucleosomes or DNA, to monitor shifts in intra-molecular distances. That would help us understand the molecular mechanism, underlying the HMGA1a nucleosome remodelling ability, and how the competition with H1 takes place.

Umritun DNA yfir í mRNA er eitt af grundvallarferlum frumunnar en umritunarferlinu sjálfu er stjórnað af sérstökum prótínum sem kallast umritunarþættir. Þeir stjórna umritun með því að bindast á ákveðnar DNA-raðir, og geta í framhaldinu kallað á mismunandi hjálparþætti sem annað hvort virkja eða bæla umritun. Umritunarþættir sem finnast í heilkjörnungum hafa allir svipaða byggingu sem gerir þeim m.a. kleift að halda úti mikilvægum störfum í genatjáningu. Allir umritunarþættir hafa svæði sem innihalda einhverskonar ómótaða byggingu en sumir þeirra eru jafn vel fullkomlega ómótaðir, þ.e. þeir hafa enga þrívíða byggingu í sínu náttúrulega ástandi. Þessi prótín eru oft kölluð óreiðukennd prótín en talið er að þau séu a.m.k. þriðjungur af prótínmengi mannsins. „High-Mobility group“ (HMG) er hópur prótína sem tilheyra fjölskyldu óreiðukenndra umritunarþátta. Þau eru þátttakendur í mörgum mismunandi ferlum innan kjarnans og hafa mikla tengingu við litnisagnirnar. Þessi prótínfjölskylda, ásamt H1 histónprótíninu, eru fyrstu prótínin sem vitað er um að hafi áhrif á byggingu litnis. Myndun þéttlitnis er einnig mjög sterklega tengd við návist H1 og vegna þessa, hefur fruman þróað ýmsa stjórnmekanisma sem gerir prótínum kleyft að keppa við H1 um að bindingu litnis. HMGA1a er eitt þessara prótína en þetta er ómótað DNA-bindiprótín sem tekur þátt í umritun, og hefur einnig þann eiginleika að geta keppt við H1. Á þeim tíma er rannsóknin stóð yfir tókst okkur að tjá og hreinsa HMGA1a prótínið með mjög góðum árangri. Þar að auki reyndum við að merkja það, með því að festa flúrljómandi efni á tvær systein aminósýrur prótínsins. Þar sem upprunalega prótínið inniheldur engar slíkar aminósýrur í röð sinni, þurftum við að nota stökkbreytta gerð þess sem innihélt tvær systein aminósýrur. Markmið rannsóknarinnar var að mynda tvímerkt prótín sem gæti verið notað til smFRET mælinga, t.d. í flóka með litnisögnum, til þess að mæla breytingar á innansameindafjarlægðum þeirra. Það myndi hjálpa okkur að skilja eiginleika HMGA1a sem gerir því kleift að endurskipulegga byggingu litnisagna, og hvernig samkeppni þess við H1 prótínsins er háttað.