Protein stability assay: A method for determining the degradation pathway of unstable proteins.

Abstract

Cellular proteostasis describes the delicate balance between protein synthesis and degradation that takes place in every cell. Some of the proteins that cells produce are folded incorrectly, disrupting their function. Sequence variants in coding regions of genes can fundamentally alter a proteins’ structure through a change in the amino acid sequence. To prevent the buildup of these abnormal proteins cells rely on degradational pathways such as the proteasomal pathway and the lysosomal pathway. Variants that decrease protein stability have been linked to various diseases and therefore determining the degradation pathway of said proteins can be clinically significant. In the research article “Systematic Profiling of DNMT3A Variants Reveals Protein Instability Mediated by the DCAF8 E3 Ubiquitin Ligase Adaptor”, a research team led by Yung-Hsin Huang determined the degradation pathway of DNMT3a (DNA methyltransferase 3) using a protein stability assay. The aim of this project was to replicate the assay and test it on variants of interest. The assay could not be fully replicated as described in the article due to the failure of a mRFP (monomeric red fluorescent protein) tag, meaning a change in approach was required. In this project I replicated the results of the research article by testing DNMT3a WT and W297Del overexpression lysates on Wes from Protein simple, establishing DNMT3a as a reliable control for any future attempt to replicate the protein stability assay.

Proteostasis lýsir viðkvæmu jafnvægi milli próteinmyndunar og niðurbrots sem á sér stað í hverri frumu. Sum prótein sem frumur framleiða virka óeðlilega, sem getur verið afleiðing af röngu sambroti og veldur því truflun á starfsemi þeirra. Þetta er algeng afleiðing mislestursbreyta í erfðamenginu sem breyta uppbyggingu próteina með breytingu á amínósýruröðinni. Til að koma í veg fyrir uppsöfnun þessara óeðlilegu próteina treysta frumur á niðurbrotsleiðir eins og próteasómalferilinn og lýsósómalferilinn. Stökkbreytingar sem draga úr stöðugleika próteina hafa verið tengdar við ýmissa sjúkdómua og því getur máli skipt fyrir þróun meðferða og lyfja að ákvarða niðurbrotsferil þessara próteina. Í rannsóknargreininni „Systematic Profiling of DNMT3A Variants Reveals Protein Instability Mediated by the DCAF8 E3 Ubiquitin Ligase Adaptor“ ákvarðaði rannsóknarteymi undir forystu Yung-Hsin Huang niðurbrotsferil DNMT3a (DNA metýl-transferasa 3) með notkun próteinstöðugleikaprófs. Markmið þessa verkefnis var að endurtaka niðurstöðu greinarinnar og prófa próteinstöðugleikaprófið á óstöðugum afbrigðum. Ekki var hægt að endurtaka prófunina eins og lýst er í greininni vegna galla í mRFP (monomeric red fluorescent protein) merki, sem þýddi að breyta þurfti nálguninni. Í þessu verkefni prófaði ég mælingu á próteinmagni DNMT3a WT og W297Del með Wes frá Protein simple og gat endurtekið niðurstöður greinarinnar og þar með sett upp DNMT3a sem stýribreytu fyrir framtíðartilraunir.