Heildstæð úttekt á gena og prótín tjáningu í brjóstastofnfumulínun D429 í tvívíðri og þrívíðri rækt og í myndun greinóttra formgerða og bandsvefsumbreytingu

Abstract

Brjóstkirtillinn er gerður úr brjóstaþekjufrumum sem mynda svokallaðar greinóttar byggingar. Þessar greinóttu byggingar myndast út frá ferli sem kallast „Branching morphogenesis“ eða myndun greinóttra formgerða. Stjórnun þessa ferlis fer fram með hormónum eins og estrógen og prógesterón og einnig út frá samspili á milli brjóstaþekjufrumna og utanáliggjandi bandvefs þess. Annað ferli sem talið er vera nauðsynlegt fyrir eðlilega myndun greinóttra formgerða í brjóstkirtilinum er bandvefsumbreyting þekjuvefs (epithelial to mesenchymal transition EMT), þar sem þekjufrumur missa þekjueignleika sína og öðlast í staðinn bandvefseiginleika, sem veitir frumum eiginleikann til þess að komast inn í nærliggjandi bandvefinn við myndun greinóttrar formgerðar. EMT sést einnig í krabbameinsfrumum og tengist verri horfum hjá sjúklingum. Stofnfrumulínan D492 hefur þekjuvefseiginleika og mynda bæði luminal- and myoepithelial í frumurækt. Þessar frumulínur voru einangraður úr vef sem fenginn var í aðgerð við brjóstaminnkun og voru frumunnar síðan voru gerðar ódauðlegar. Þegar D492 frumur eru ræktaðar í þríviðri rækt mynda þær greinóttar byggingar, sem er í líkingu við TDLU (terminal duct lobular unit) í brjóstkritlinum. Frumulínan D492M var fengin út frá D492 frumum með því að rækta D492 frumur í samrækt með brjóstaæðaþelsfrumum (breast endothelial cells BRENCs). Frumulínan D492M hefur bandvefseiginleika snældulaga byggingar í þríviðri frumurækt. Í þessari tilraun RNA raðgreindum við frumulínunnar D492 og D492M í bæði þrí- og tvíviðri frumurækt. Markmiðið var að komast að því hvaða gen og líffræðilegir ferlar taka þátt í þroskun greinóttra byggingar D492 frumna í þríviðri rækt. Við könnuðum einnig hvaða gen og líffræðilegir ferlar taka þátt í EMT ferli D492 frumna yfir í D492M frumur í bæði þrí- og tvíviðri frumurækt. D492 frumur voru ræktaðar í þríviðri rækt í 7, 14 og 21 daga, ásamt því að vera ræktaðar í einlagi. Frumulínan D492M var ræktuð í einlagi, en aðeins ræktuð í 14 daga í þríviðri rækt. RNA gögnin sem fengust voru magngreind með Kallisto. Forritið Sleuth var notað til þess að greina breytingar á tjáningarmunstri gena á milli sýna. Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) var notuð til þess að greina auðgaða líffræðilega ferla. Gene Ontology (GO) greiningar voru gerðar samhliða GSEA þar sem 20 efstu hub genin voru notuð í greiningunni.

The breast gland is made up of epithelial cells, which structurally form a branched ductal tree. Branching morphogenesis is required for the formation of the epithelial branched ductal tree, it is a process which is orchestrated by systemic hormones such as estrogen and progesterone, along with paracrine signaling between the epithelial cells and the surrounding stroma. Another process which is also thought to be necessary for normal branching development in the breast gland is epithelial to mesenchymal transition (EMT), which is when epithelial cells lose their epithelial attributes and instead gain mesenchymal characteristics, providing the cells with the ability to penetrate the surround stroma during branching morphogenesis. The stem cell line D492 has epithelial characters and produces both luminal- and myoepithelial cells in cell culture. This cell line was isolated from reduction mammoplasty and subsequently immortalized. When D492 cells are cultured in 3D conditions they form branching structure colonies, parallel to the terminal ductal lobular unit (TDLU) in breast glands. The cell line D492M was derived from D492 cells by co-culturing D492 cells with breast endothelial cells (BRENCs). The D492M cell line displays mesenchymal characteristics and forms spindle-like colonies when cultured in 3D conditions. In this experiment we RNA-sequenced D492 and D492M cell cultures in both 3D and 2D. The aim was to discover what genes and biological processes are involved in the development of D492 branching structures in 3D conditions. We also investigated what genes and biological processes are involved during the EMT of D492 cells to D492M cells in both 3D and 2D conditions. Lastly, we compared 3D with 2D cultures in both D492 and D492M cells. D492 cells were cultured in 3D conditions for 7, 14 and 21 days and in monolayer. The D492M cell line was cultured in monolayer but was only cultured for 14 days in 3D conditions. RNA data was quantified using Kallisto. Sleuth was used to perform differential gene expression analyses between samples. Enrichment of biological processes was detected using Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Ontology (GO) analyses were also performed alongside GSEA using the top 20 hub genes from each sample