Undireiningar próteasóma: Undirbúningur fyrir flúrmerkingar þriggja undireininga próteasóma í D.melanogaster

Abstract

Erfðatækniaðferðin CRISPR/Cas9 hefur valdið byltingarkenndum framförum á sviði vísinda með því að gefa færi á að breyta erfðamengi lífvera á markvissan og skilvirkan hátt. Í þessu verkefni voru gRNA hönnuð til að þekkja ákveðin markset nærri stopptákna genanna Rpn11, Prosβ5 og Rpt1 í erfðamengi D.melanogaster. Genin eru hluti af undireiningum próteasóma og gegna því hlutverki í ferlum sem tengjast umbyltu próteina innan fruma. Verkefnið er framkvæmt í þeim tilgangi að koma inn flúrmerkingum á genin til að greina megi staðsetningu og samskipti þeirra við önnur prótein in vivo. Við undirbúning CRISPR raðbreytinga með endurröðunarviðgerð (e. Homology Directed Repair) í flugu þarf að klóna nauðsynlega hluta kerfisins í plasmíð. Til þess var gRNA röðum fyrst komið inn í tjáningarplasmíð fyrir lítil RNA. Síðan voru raðir umhverfis þann stað sem breyta átti í erfðamengi flugunnar klónaðar inn í gjafaplasmíð, í þeim tilgangi að koma síðar fyrir þeim erfðaröðum sem skjóta átti inn í erfðamengið. Tvö gRNA plasmíð voru útbúin fyrir hverja undireiningu og sprautað í flugufóstur til að meta erfðabreytingahæfni hvers gRNA. T7 endonúkleasa próf var af lokum framkvæmt en niðurstöður reyndust ófullnægjandi til að meta skilvirknina. Við framhald verkefnisins verður flúrpróteinröð ásamt stuttri tengiröð klónuð úr s.k. pPickUP plasmíði og henni skotið með einu 2ja búta Gibsonhvarfi inn í markröðina í tilvonandi gjafaplasmíði (pKnockIn). Þannig þarf aðeins að klóna markröðina og hvert flúrpróteinmerki einu sinni til að geta útbúið fjölda ólíkra gjafaplasmíða fyrir hvert markgen.