Aðferð til normaliseringar mælinganiðurstaðna á thrombinmyndun með samhliða mælingu á sérvöldu blóðvatni heilbrigðra einstaklinga

Abstract

Bakgrunnur: Sjálfvirk mæling á myndun þrombíns (automated thrombin generaration, ATG) hefur fræðilega nær takmarkalausa möguleika til mats á blóðstorknun, t.d. sem mæling á blæðingar- eða ofstorkunartilhneigingnu eða mæling á áhrifum segavarnalyfja. Notagildi ATG hefur hins vegar takmarkast af miklum innanmælingabreytileika (intraassay variability) og millimælingabreytileika (frá einum tíma til annars, interassay variability) auk hvarfefna-, mælitækja- og notendaháðs breytileika. Breytileikinn hefur komið í veg fyrir almenna klíniska notkun ATG aðferðarinnar og hefur hindrað samanburð milli vísindarannsókna. Markmið: Tilgáta okkar var að normalisering ATG mælinganiðurstaðna með vel völdu eðlilegu plasmasafni (pooled normal plasmas, PNP) í viðbót við notkun staðlaðra hvarfefna framleiðanda og kvörðunasýna (calibrators) myndi innan- og millimælingabreytileiki minnka. Aðferðir: ATG mælingar voru gerðar af einum notanda á eitt mælitæki. Stöðluð blóðstorkupróf voru gerð auk frumuflæðisjárgreiningar. Hvarfefni voru af mismunandi lotum framleiðanda. Rannsökuð voru mismunandi plasmasöfn (PNP): Frosið innanhúss útbúið tvöfalt niðurskilið PNP, þrjár mismunandi lotur frystra PNP viðurkennds framleiðanda og ein lot frostþurrkaðs PNP annars framleiðanda. ATG var metið í tvíniðurskildum plasmasýnum 30 heilbrigðra einstaklinga. Agnarusl í PNP var greint með flæðifrumusjármælingum.Niðurstöður: Hráar, kvarðaðar ATG mælingar á PNP sýnum höfðu lágan innanmælingarbreytileika, þ.e. fráviksstuðullinn (CV%) var undir 6% fyrir hámarks ATG (Peak TG) og undir 3,7% fyrir heildar ATG (ETP, endogenous thrombin potential). Millimælingabreytileiki var innan við 10,7% fyrir Peak TG og innan 3,1% fyrir ETP. Aðkeypta frysta plasmað PNP GK7370 passaði best við ATG miðgildi heilbrigðra einstaklinga sem var valið sem viðmiðsplasma til normaliseringar niðurstaðna. Með því að nota stöðluð hvarfefni og viðmiðsplasmað í hverri mælingarkeyrslu hélst millimælingabreytileiki <12% fyrir Peak TG og <4,1% fyrir ETP. Þegar mismunandi hvarfefni voru notuð og niðurstöður voru normaliseraðar með GK7370 minnkaði millimælingabreytileiki í plasmasöfnum verulega, þ.e. fráviksstuðullinn minnkaði um 74% fyrir ETP, 78% fyrir Peak TG og 92% fyrir tíma til hámarks TG (time to peak TG). Vefjaþáttur (tissue factor) fannst ekki í PNP með frumuflæðisjárgreiningu. Ályktanir: Normalisering ATG með frosnu PNP sem gaf niðurstöður nálægt miðgildi í heilbrigðra einstaklinga leiddi til verulegrar minnkunar millimælingabreytileika þegar mismunandi hvarfefni voru notuð.

Background: Automated thrombin generation (ATG) assessment theoretically has an almost limitless potential for assessing anticoagulation as well as hypercoagulable and bleeding phenotypes. However, ATG assessment has been limited by high intra- and especially inter-assay as well as reagent-dependent variation. This has complicated ATG comparison from one center or study to another and has deterred clinical usability of the assay. Aim: We hypothesized that within-run normalization of thrombin generation results using a suitable pooled normal plasma (PNP) in addition to applying standardized manufactured reagents and calibrators would reduce such variations. If successful, normalization would provide an improved ATG method and also a clinically meaningful unit that might bring ATG closer to clinical use. Methods: A single user measured ATG and standard clinical laboratory coagulation tests in pooled normal plasmas (PNPs) of different origin using a single manufacturer´s instrument and different lots of standard reagents. The tested PNPs included an in-house prepared double-centrifuged PNP frozen plasma, different lots of commercial frozen PNPs and a single lot of lyophilized PNP. ATG was also assessed in double-centrifuged plasma samples from 30 healthy individuals. Particle debris present in the plasmas was assessed using flow cytometric methods.Results: The raw calibrated ATG intra-assay variation performed on the PNPs was very low, i.e. coefficient of variation (CV%) below 6% for Peak TG and below 3.7% for ETP. Raw data inter-assay variation was within 10.7% for the Peak TG and within 3.1% for the ETP. The manufactured frozen plasma PNP GK7370 fitted best the median ATG in our normal cohort and was therefore selected as normalizator plasma. The in-house and lyophilized PNPs were less suitable for normalization. Using the selected normalizator plasma and standardized reagents, inter-assay variation remained low (below 12% for peak TG and 4.1% for ETP). Furthermore, following normalization, reagent lot-to-lot variation (CV%) was markedly reduced, i.e. 74% for ETPs, 78% for Peak TG and 92% for time to peak TG. Flow cytometry did not identify tissue factor in the PNPs although some debris of platelet membrane origin was present.Conclusions: Normalization of ATG using a frozen PNP that had ATG results fitting the median ATG of a normal cohort led to a marked reduction in reagent lot-to-lot variation. Normalization of ATG results by reducing reagent-dependent variation may help open the door for ATG use in clinical practice and comparative studies.