Isolation of plasma-derived extracellular vesicles using immunoaffinity capture for breast cancer biomarker discovery

Abstract

Breast cancer (BC) accounts for 31% of all cancer diagnoses among women, with incidence rates steadily rising. Diagnosis of BC utilizes three tests, a clinical evaluation, imaging using mammography or ultrasounds and tissue biopsies. Innovation is required to keep pushing mortality rates down, and liquid biopsies are one exciting avenue of research. Liquid biopsies are less invasive than traditional biopsies, but a lack of biomarkers remains a challenge in the field. Extracellular vesicles (EVs) are a nano sized particles secreted from all cells within the body for a variety of functions including signal transmission and immunomodulation. EVs contain a diverse set of cargo including proteins, lipids and metabolites. Their presence in all physiological liquids of the body makes them prime targets as a matrix for biomarkers for BC. Previous research has focused on examining the protein and micro-RNA content of EVs, but the lipidomics of EVs remain a relatively unexplored field. The aim of this study was therefore to evaluate immunoaffinity chromatography and size exclusion chromatography as methods to isolate EVs from plasma for lipidomic analysis using liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS/MS), and to evaluate useful data can be obtained from small amounts of plasma using EV isolation.This study isolated EVs from plasma samples as well as MDA cell culture utilizing immunoaffinity chromatography and size exclusion chromatography. Isolated EVs were analysed using nanoparticle tracking analysis, simple western blot, MicroBCA protein assays and cholesterol assays. Isolated EVs then underwent LC/MS analysis.EVs were successfully isolated from 0,5 mL of plasma with the average mean size of 116,2 nm using immunoaffinity chromatography and lipidomic analysis using LC/MS/MS identified 151 lipids with a high degree of accuracy. A decrease in EV particle concentration, protein concentration and cholesterol concentration was observed as the plasma sample underwent more freeze thaw cycles.This thesis shows that immunoaffinity isolation can be used to isolate EVs from small amounts of plasma for LC/MS lipidomic analysis. Furthermore, some of the detected lipids such as triglycerides are known to be enriched in BC, pointing to applications in BC diagnosis.

Brjóstkrabbamein er tegund krabbameins sem telst til 31% af allra krabbameinsgreininga meðal kvenna. Greining á brjóstakrabbameini notar þrjú próf, klínískt mat, myndgreiningu með brjóstamyndatöku eða ómskoðun og vefjasýni. Nýsköpun er nauðsynleg til að halda áfram að lækka dánartíðni, og ein spennandi ný rannsóknarleið eru vökvasýni. Vökvasýni eru ekki jafn ífarandi en vefjasýni, en skortur á lífmerkjum til að skima fyrir er enn áskorun í þessu sviði.Utanfrumubólur eru nanóagnir sem eru seyttar úr öllum frumum líkamans. Utanfrumubólur gegna mörgum mikilvægum hlutverkum í líkamanum, þar á meðal boðamiðlun á milli frumna og ónæmistjórnun. Utanfrumubólur hafa fjölbrett innihald, þar á meðal prótein, lípíð og umbrotsefni. Þar sem utanfrumubólur eru til staðar í öllum vökvum líkamans eru þau gott skotmark sem mögulegt ílat fyrir lífsmerki fyrir brjóstakrabbamein. Fyrri rannsóknir hafa beinst að því að kanna prótein- og ör-RNA innihald utanfrumubóla, en lípíðsamsetning utanfrumubóla hefur ekki verið kannað jafn ítarlega. Markmið þessarar rannsóknar var því að meta mótefnasækni og aðskiljun eftir stærð sem einangrunaraðferðir fyrir utanfrumubólur úr blóðvökva fyrir greiningu með vökjvaskiljun-massagreiningu og meta hve mikið af plasma þarf fyrir einangrun.Í þessari rannsókn voru utanfrumubólur einangraðar með mótefnasækni og aðskiljun eftir stærð. Einangraðar utanfrumubólur voru greinar með nanóagnagreiningu, simple western blot, MicroBCA prótein mælingum og kólesterólmælingum. Einangraðar utanfrumubólur voru síðan skoðaðar með vökjvaskiljun-massagreiningu.Utanfrumubólur voru einangraðar með mótefnasækni úr 0,5 mL af plasma með meðalstærð 116,2 nm. Greining á lípíð innihaldi utanfrumubóla var gerð með vökjvaskiljun-massagreiningu, og 151 efnasambönd voru greind með mikilli nákæmni. Lækkun á agnafjölda, próteinstyrk og kólesterólstyrk eftir því sem plasma sýni gékk í gegnum frostþýðingarlotur.Þessi ritgerð sýnir að það er hægt að nýta mótefnaeinangrun til að einangra EVs úr litlu magni af plasma fyrir LC/MS greiningu á lípiðum. Sum lípíð sem voru greind í rannsókninni eins og þríglýseríð hafa verið greind í auknu magní BC frumum í öðrum rannsóknum, sem