Cloning a light-inducible Cre (LiCre) for optimization in hESCs

Abstract

Optogenetic fusion proteins have allowed researchers to gain control of various biological processes. The fusion of the asLOV2 domain from Avena sativa (oats) and a truncated Cre recombinase led to the development of a light-inducible Cre recombinase called LiCre (Duplus-Bottin et al., 2021). LiCre has significant promise as a tool for gene manipulation if its activity is increased. To optimize the activity of this recombinase in stem cells, a plasmid was created that can ubiquitously express LiCre while providing a recombination reporter for functional testing. This project used restriction cloning to create three plasmids with different promoters to drive LiCre expression in H1-hESCs. The plasmid demonstrating the highest expression of LiCre will be used to compare different asLOV2 domains, aiming to improve the activity of LiCre in stem cells.

Ljósvirk samrunaprótein hafa gert vísindafólki kleift að ná stjórn á fjölmörgum líffræðilegum ferlum. Samrunaprótein asLOV2 hneppisins úr Avena sativa (höfrum) og styttu Cre endurröðunarpróteini leiddi til þróunar á ljósvirku Cre, nefnt LiCre (Duplus-Bottin et al., 2021). Með bættri endurröðunartíðni, gæti LiCre orðið nytsamlegt tól til skilyrtra erfðabreytinga. Til að bæta virkni próteinsins í stofnfrumum verður plasmíð klónað sem getur tjáð LiCre og er með innbyggða klöguskjóðu sem virkjast við endurröðun. Í þessu verkefni voru þrír stýrlar klónaðir í plasmíð til að tjá LiCre í H1-hESC stofnfrumulínu. Stýrillinn með mestu virknina verður notaður til að stjórna tjáningu á LiCre með mismunandi asLOV2 hneppum til að finna LiCre afbrigði með aukna virkni.