Characterization of a Vertebrate Specific Region of ATG7

Abstract

The autophagy pathway, mediated by autophagy related genes (ATGs), is activated by cellular stress and is important for cellular homeostasis. Atg7 is a key autophagy gene, and mammalian cells lacking Atg7 are unable to facilitate lipidation of LC3. A vertebrate specific region (VSR) of Atg7 has been identified, containing essential amino acids for the lipidation of LC3. This study aimed to explore if Atg7 from Drosophila and yeast, species naturally lacking the VSR, are able to facilitate the lipidation of LC3 in mammalian cells. The importance of the Serine residue 531 (S531) within the VSR of human ATG7 was furthermore determined. This residue is positively selected and has been shown to be phosphorylated in breast cancer. Mouse embryonic fibroblasts with a knockout of Atg7 (Atg7-/- MEFs) were transfected with yeast, Drosophila or human Atg7 constructs in order to assess the ability to rescue the LC3 lipidation defect in these cells. To assess the importance of S531, human ATG7 constructs with S531A, S531D or S531E mutations were used, with the latter two mimicking phosphorylation of the site. The objective was to shed light on a vertebrate specific function of Atg7, increasing our understanding of the function of this essential gene in health and disease. Western blot showed that the Drosophila and yeast Atg7 rescue experiments were unsuccessful because the Atg7-/- MEFs used for transfection were likely not Atg7-/-, and there was no statistical significance between the lipidation of LC3 of the S531 mutations. Thus, the experiments must be repeated.

Sjálfsátsferillinn er mikilvægur í frumustarfsemi. Hann er virkjaður af frumubundinni streitu og miðlað af sjálfsátsgenum (ATGs). Atg7 er lykil sjálfsátsgen, og spendýrafrumur sem eru án gensins geta ekki lípíderað LC3. Hryggdýrasértækt svæði (VSR) af Atg7 hefur fundist og það inniheldur nauðsynlegar amínósýrur fyrir lípíderingu á LC3. Markmið verkefnisins var að komast að því hvort Atg7 úr gersvepp og ávaxtaflugu, en það eru dýrategundir sem eru án VSR, gætu komið af stað lípíderingu á LC3 í spendýrafrumum. Mikilvægi serínleifar 531 (S531) innan VSR á manna ATG7 var einnig kannað. Leifin hefur gengist undir jákvætt val og sýnt hefur verið fram á að hún sé fosfórýleruð í brjóstakrabbameinum. Atg7 úr gersvepp, ávaxtaflugu og manni voru tjáð í músa fósturvísis trefkjakímfrumur án Atg7 (Atg7-/- MEFs) til þess að skoða hvort þau gætu bjargað lípíderingu á LC3 í frumunum. Til að kanna mikilvægi S531 voru manna ATG7 plasmíð með S531A, S531D og S531E stökkbreytingar innleiddar í Atg7-/- MEF frumur, en seinni tvær stökkbreytingarnar líkja eftir fosfórýleringu á setinu. Markmiðið var að lýsa hryggdýra sértækri virkni Atg7, til þess að auka skilning á hlutverki þessa lykilgens í heilbrigðum frumum og sjúkdómum. Western blot sýndi að Atg7 úr ávaxtaflugu og gersvepp voru tjáð í Atg7-/- MEF frumum sem reyndust svo líklega ekki vera Atg7-/- og það var ekki tölfræðilega marktækur munur á lípíderingu á LC3 á milli S531 stökkbreytinganna. Því var niðurstaðan sú að það þyrfti að endurtaka tilraunirnar.