Stöðlun á aðferðum til greiningar á utanfrumuerfðaefni í plasma

Abstract

Utanfrumuerfðaefni (e. cell-free DNA, cfDNA) eru litlir erfðaefnisbútar sem eru til staðar í blóðrásinni og öðrum lífvökvum. Utanfrumuerfðaefni losnar út í blóðrásina m.a. þegar frumur fara í skipulagðan frumudauða eða þegar þær deyja með nekrósu. Rannsóknir á utanfrumuerfðaefni kallast lífvökvasýnataka (e. liquid biopsies). Þessar rannsóknir geta gefið góðar upplýsingar um heilsufar fólks með mjög einfaldri sýnatöku. Með lífvökvasýnatökum er hægt að leita eftir alls kyns lífmerkjum (e. biomarkers) eða stökkbreytingum sem eru einkennandi fyrir sjúkdóma eins og krabbamein. Takmarkanir við lífvökvasýnatökur er að mjög lítið magn af utanfrumuerfðaefni er í blóðrásinni og því getur reynst erfitt að finna stökkbreytingar eða lífmerki sökum þess að þær eru í svo litlu magni í blóðrás. Því er mjög brýn þörf á því að staðla aðferðir til að einangra utanfrumuerfðaefni í blóðrás, sem og aðferðir til að gera rannsóknir á því. Lífvökasýnatökur eru mjög hratt vaxandi í heilbrigðisvísindum og eru miklar vonir bundnar til þeirra í framtíðinni í læknavísindum. Markmið verkefnisins var að bera saman tvær aðferðir til einangrunar á utanfrumuerfðaefni í plasma, mæla stærðir á erfðabútunum og magnmæla með ddPCR (e. digital droplet PCR) og Qubit. 38 sjálboðaliðar gáfu tvö blóðsýni, sem voru síðan notuð til að einangra cfDNA með tveimur mismunandi aðferðum. Þessar aðferðir eru sjálfvirk Chemagen aðferð, sem byggir sína einangrun á bindingu erfðaefnis við segulkúlur, og handvirk Qiagen aðferð, sem notar aðsog sýnis að kísilhimnu til einangrunar á utanfrumuerfðaefni. Chemagic 360 tækið frá Chemagen var notað til einangrunar með Chemagen tækni, en QIAvac kerfið frá Qiagen var notað til einangrunar með Qiagen aðferðinni.Magnmælt var erfðaefni í sýninu með Qubit, stærðir erfðaefnabúta í sýni voru metnar með Agilent Bioanalyzer og frekari magnmæling var framkvæmd með ddPCR. Niðurstöður sýndu að marktækur munur reyndist á magnmælingum með Qubit og ddPCR. Qiagen kísilhimnuaðferðin reyndist magnmæla meira af cfDNA bæði með Qubit flúrljómunarmælingu og ddPCR. Chemagen segulkúluaðferðin reyndist þó stöðugri milli keyrsla, bæði í einangrun og magnmælingu og reyndist meira af DNA af háum mólmassa (e. high-molecular weight DNA, HMW DNA) í þeim sýnum sem einangruð voru með Chemagen aðferðinni. Svipað mikið af cfDNA hlutfalli af heild var í sýnunum eftir einangrun. Þessar niðurstöður sýna að báðar einangrunaraðferðirnar virðast skila af sér hreinu cfDNA, en nokkrir þættir skilja aðferðirnar í sundur. Stöðugleiki Chemagen aðferðarinnar á Chemagic 360 tækið er líklega útskýrður með sjálfvirkni aðferðarinnar, á meðan að meira rými er fyrir mistök með handvirkri einangrun með Qiagen aðferðinni. Frekari rannsókna er þörf til að meta til fulls hvor aðferðin henti betur til einangrunar á cfDNA.