is Íslenska en English

Lokaverkefni (Bakkalár)

Háskóli Íslands > Verkfræði- og náttúruvísindasvið > B.S. verkefni - Verkfræði- og náttúruvísindasvið >

Vinsamlegast notið þetta auðkenni þegar þið vitnið til verksins eða tengið í það: https://hdl.handle.net/1946/47173

Titill: 
  • Titill er á ensku The effects of limited SMO expression on HH signaling in chondrogenic cells
  • Áhrif takmarkaðrar SMO tjáningar á HH boðferlið í brjóskmyndandi frumum
Námsstig: 
  • Bakkalár
Útdráttur: 
  • Útdráttur er á ensku

    Osteoarthritis (OA) is the most common form of arthritis and can cause destruction of the joint cartilage. Several signaling pathways have been linked with OA formation and severity, hedgehog (HH) signaling being one of them. HH signaling pathway is necessary for development and the Smoothened (SMO) membrane protein takes part in activating gene expression of HH target genes. The SMOR173C mutation has been found to increase the likelihood of OA. Expression of different SMO variants in chondrocytes could reveal more information about the role of SMO and how it affects the HH pathway. Previous studies utilized strong overexpression of SMO resulting in concentration-dependent inhibition of the HH pathway. This study aimed to generate a plasmid driving weak expression of the SMO protein to determine the role of limited SMO expression on HH activation. PCR amplification and Gibson cloning was used to generate a pCRYS-SMO-HALO-IRES-PURO plasmid. Colony cracking assay was used to search for positive clones and the plasmids restriction digested. Two samples were sent for Sanger sequence analysis and in continuation to a whole plasmid sequence analysis. This showed that the pCRYS-SMO-HALO-IRES-PURO plasmid was successfully made without mutations. To verify that the plasmid drives the expression of Smo protein with HaloTag, Smo-/- ATDC5 cells were transfected with the pCRYS-SMO-HALO-IRES-PURO plasmid and in-gel analysis and western blotting performed. In-gel analysis was unsuccessful, but western blotting results indicate some Smo protein expression. Although not all the goals of this project were achieved, the plasmid was created which can be used in further experiments.

  • Slitgigt (OA) er algengasta form gigtar og getur valdið niðurbroti liðbrjósks. Nokkrar boðleiðir hafa verið tengdar við OA myndun og alvarleika, hedgehog (HH) boðleiðin er ein þeirra. HH boðleiðin er nauðsynleg fyrir þroskun og er aðalþátttakandi ferilsins Smoothened (SMO) himnupróteinið sem leiðir til virkjunar á tjáningu markgena HH boðferilsins. SMOR173C stökkbreytingin hefur reynst auka líkur á OA. Með því að tjá mismunandi SMO afbrigði í brjóskmyndandi frumum ættu að fást meiri upplýsingar um hlutverk SMO og hvernig það hefur áhrif á HH boðferlið. Fyrri rannsóknir notuðust við mikla yfirtjáningu á SMO sem leiddi til magnbundinnar hömlunar á HH boðferlinu. Þessi rannsókn miðar að því að útbúa plasmíð sem knýr aðeins veika tjáningu SMO próteinsins til að ákvarða áhrif SMO tjáningar á HH virkjun. PCR mögnun og Gibson klónun var beitt til að mynda pCRYS-SMO-HALO-IRES-PURO plasmíðið. Skimað var eftir jákvæðum klónum með því að keyra innihald sprengdar þyrpinga á geli og greina stærð plasmíðanna. Plasmíð úr þeim klónum voru því næst einöngruð og skerðimelt. Tvö sýni voru send í Sanger raðgreiningu og í framhaldinu í heilraðgreiningu. Til að sannreyna hvort pCRYS-SMO-HALO-IRES-PURO plasmíðið gæti knúið tjáningu Smo próteins með HaloTag voru ATDC5 frumur genaleiddar með plasmíðinu og settar í gegnum sýklalyfjaval. Bæði greining í geli og westernþrykk voru framkvæmd á Smo-/- ATDC5 frumum. Greining í geli var misheppnuð og westernþrykkið sýndi ekki sannfærandi niðurstöður en benti þó til einhverrrar Smo prótein tjáningar. Þó ekki hafi tekist að ljúka öllum markmiðunum þá tókst að búa til plasmíðið sem hægt er að nota í áframhaldandi tilraunir.

Samþykkt: 
  • 21.5.2024
URI: 
  • http://hdl.handle.net/1946/47173


Skrár
Skráarnafn Stærð AðgangurLýsingSkráartegund 
BS_BMR_0412032420.pdf5.72 MBOpinnHeildartextiPDFSkoða/Opna
BMR_yfirlysing_0412032420.pdf192.1 kBLokaðurYfirlýsingPDF