Quantification of Microglia: Adapting Methods of Semi-Automated Quantification of Microglia

Abstract

As age increases, the chances of metabolic, vascular, and neurodegenerative diseases increase, putting much pressure on the healthcare systems around the globe. Although researchers across institutions are attempting to cure ageing, studying its basics can help alleviate this burden. As immune cells in the brain, microglia play a vital role in defending against injuries or diseases that may impact the central nervous system. However, these cells are not immune to the effects of ageing as they are known to degenerate and lose their neuroprotective functions. This thesis focused on developing an image analysis pipeline to allow future analysis of the changes in microglia cells throughout their lifespan. The template was established using older animals to ensure an accurate image pipeline, and that the macros would work with the most challenging conditions. Results showed no significant difference in microglia density between mice brains aged three months and twenty months. The 2D macro, or the two-signal macro, used Ilastik segmentations made from z-projections of two separate channels from an image. The macro would then quantify cells based on how large the signal percentage of channel 1 (DAPI) was in the segmented cell from channel 2 (Iba-1 stained). When compared to manual quantifications, this macro showed a high false positive and false negative cell counts compared to the true positive. The 3D macro worked with only the Iba-1 channel by segmenting the microglia cells in a circular manner and would quantify them using the 3D manager plug-in in Fiji. By limiting the volume of the cells quantified using R, the macro showed decreased false positive and negative counts when compared to the 2D macro.In conclusion, the 3D macro showed promising results, but only for small areas. Even if the 2D macro did not yield correct quantifications, it did reveal how segmenting with Ilastik creates a good basis for further morphological analysis.

Með hækkandi aldri aukast líkur á sjúkdómum tengdum meltingar-, æða- og taugakerfi sem eykur álag á heilbrigðiskerfin víðs vegar um hnöttinn. Þrátt fyrir að fræðimenn reyni að lækna öldrun þá er einnig mikilvægt að rannsaka grunnþættti hennar til að létta undir með heilbrigðiskerfum. Örtróðsfrumur eru ónæmisfrumur í heilanum sem eiga ríkan þátt í því að verja gegn skaða eða sjúkdómum sem hafa áhrif á miðlæga taugakerfið. Hinsvegar hefur öldrun einnig áhrif á þessar frumur og er talið að þeim hraki með aldrinum og minnki þá geta þeirra til þess að genga ætluðu hlutverki sínu.Þetta verkefni stefndi að því að þróa myndgreiningarkerfi (en: image analysis pipeline) til þess að geta greint breytingar á þéttni örtróðsfrumna eftir aldri. Þetta var gert þeð því að búa til tvær tegundir af fjölvaskipunum (en: macro), sem myndu gera talningarnar sjálfvirkar. Eldri dýr voru notuð við stofnun fjölvaskipunarinnar til þess að ganga úr skugga um að myndgreiningin væri nákvæm við krefjandi en þekktar aðstæður. Niðurstöður sýndu engan marktækan mun á þéttni örtróðsfrumna í músa heilum úr þriggja mánaða gömlum músum annars vegar og tuttugu mánaða gömlum músum hinsvegar. 2D fjölvskipunin eða tveggja svæða fjölvskipunin, notaðist við Ilastik sundurliðun (en: segmentation) sem samanstóð úr z-ásýndi frá tveimur aðskildum rásum frá myndinni. Fjölvskipunin taldi þá frumur miðað við prósentu styrks af svæðinu hjá rás 1 (DAPI). Þegar talning kerfisins var borin saman við uppruna talningu, sýndi þetta macro háa tíðni af fals-jákvæðum og fals-neikvæðum frumutalningum miðað við rétt jákvæða talningu. 3D-fjölvskipunin notaði aðeins eina rás (Iba-1) og sundurliðaði örtróðfrumurnar í hring og taldi þær svo með 3D-manager íbót úr Fiji. Fjöldi frumu talninga var takmarkaður með R og þá sýndi þetta að 3D- fjölvskipunin gaf fals-jákvæðar og neikvæðar niðurstöður miðað við 2D-fjölvskipunina. 3D-fjölvskipunin sýndi vænlegar niðurstöður en aðeins á litlum flötum. Þrátt fyrir að Ilastik sundurliðunin hafi ekki veitt góða frumutalningu sýndi það fram á notagildi Ilastik í fleiri rannsóknum.