Útsláttur á RVB1 og RVB2 genum Saccharomyces cerevisiae með CRISPR/Cas9 og uppbót með hliðstæðum genum annarra tegunda

Abstract

Markmið þessa verkefnis var að kanna hvort hægt væri að bæta upp úrfellingu á lífsnauðsynlegu genunum RVB1 og RVB2 í gersveppnum Saccharomyces cerevisiae með samsvarandi (e. orthologous) genum úr fjórum öðrum lífverum: Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Schizosaccharomyces pombe og Kluyveromyces marxianus. Ásamt CRISPR/Cas9 kerfinu var notast við superloserplasmíð sem tjáðu RVB1 og RVB2 úr náskyldu gersveppategundinni S. eubayanus svo hægt væri að fella út RVB1 og RVB2 af litningi S. cerevisiae. Síðar átti að velja á móti superloserplasmíðunum með 5-FOA. Þrátt fyrir ýmsar áskoranir í verkefninu tókst að staðfesta rétta meltingu á plasmíði með skerðiensíminu NotI, sem benti til árangursríkrar klónunar ásamt því að ummynda pontin og reptin úr S. Pombe í E. coli. Tilraunir á gersveppaummyndunum með samsvarandi genum úr lífverunum fjórum voru hafnar en kláruðust ekki innan tímamarka.Verkefnið var krefjandi en veitti mikilvæga innsýn í notkun CRISPR/Cas9 flókans við úrfellingu gena og björgun með hliðstæðum genum úr öðrum lífverum ásamt þeim áskorunum sem því fylgja. Það sýndi einnig mikilvægi þess að vera með góða rannsóknaráætlun og nægan tíma til rannsóknarvinnu. Þrátt fyrir að verkefnið hafi ekki verið klárað innan tímamarka skilaði það niðurstöðum og mikilvægri reynslu í aðferðumsameindalíffræðinnar sem mun nýtast í frekari rannsóknum.

The aim of this project was to investigate whether CRISPR/Cas9 gene knockout of the essential genes RVB1 and RVB2 in the yeast species Saccharomyces cerevisiae could be compensated for by homologues from four other organisms: Homo sapiens, Drosophila melanogaster, Schizosaccharomyces pombe and Kluyveromyces marxianus. Superloser plasmids expressing RVB1 and RVB2 from the closely related yeast species S. eubayanus were used in conjunction with the CRISPR/Cas9 system in order to perform a knockout RVB1 and RVB2 from the S. cerevisiae genome. Later, selection was to be done against the superloser plasmid using 5-FOA. Despite several challenges in the project, it was possible to confirm correct digestion of a plasmid using the restriction enzyme NotI, indicating successful cloning, and to transform pontin and reptin from S. pombe into E. coli. Experiments on yeast transformations with orthologous genes from the four species were initiated but not completed within the time limit.The project was challenging but provided important insights into the use of the CRISPR/Cas9 system for gene knockouts and transgenetic replacements, as well as the challenges that come with it. It also showed the importance of having a good research plan and sufficient time for research work. Although the project was not completed within the time limit, it yielded results and important experience in methods of molecular biology that will be useful in further research.